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在ELISA試劑盒中,進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)條件的挑選是很重要的,其間包括:
(1) 固相載體的挑選:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。現(xiàn)在常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不論何種載體,在使用前均可進(jìn)行篩選:用等量抗原包被,在同一試驗(yàn)條件下進(jìn)行反響,調(diào)查其顯色反響是否均一性,據(jù)此判明其吸附功能是否良好。
(2) 包被抗體(或抗原)的挑選:將抗體(或抗原)吸附在固相載體外表時(shí),要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度,時(shí)刻及其蛋白量也有一定影響,一般多選用4℃ 18~24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進(jìn)行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后,在其它試驗(yàn)條件相同時(shí),調(diào)查陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。挑選OD值大而蛋白量較少的濃度。關(guān)于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1~10μg/ml。
(3) 酶符號(hào)抗體作業(yè)濃度的挑選:首先用直接ELISA試劑盒法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見酶符號(hào)抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參閱品及酶符號(hào)抗體分別為不同的稀釋度)在正式試驗(yàn)系統(tǒng)里地滴定其作業(yè)濃度。
(4) 酶的底物及供氫體的挑選:對(duì)供氫體的挑選要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反響,而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,應(yīng)留意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是現(xiàn)在較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)刻后,應(yīng)參加強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反響。通常底物作用時(shí)刻,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是H2O2在臨用前參加。